A549貼壁培養細胞株優(yōu)惠大 "

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傳代細胞培養：原代細胞或細胞株或細胞系需在體外持續地培養就傳代，以便獲得穩定的原代細胞或細胞株或細胞系或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續，這個(gè)過(guò)程體外培養稱(chēng)為傳代細胞培養。一般認為，細胞培養形成單層匯合，細胞密度與生存空間有密切的關(guān)系，將培養細胞分散，以1:2或l:3或1:4以上的比率轉移分散進(jìn)行培養，即為傳代細胞培養。細胞傳代后，一般經(jīng)過(guò)三個(gè)階段：游離期、指數增生期和停止期。
常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數/100個(gè)細胞。一般細胞分裂指數介于0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力好時(shí)期，稱(chēng)指數增生期(對數生長(cháng)期)，適宜進(jìn)行各種試驗。
傳代細胞的培養：（1）吸除或倒掉原瓶中的舊培養基（以25mL培養瓶為例）。（2）每瓶加入2mL,無(wú)鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。（3）每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），輕輕搖動(dòng)培養瓶，經(jīng)消化液鋪滿(mǎn)所有細胞表面，待細胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀(guān)察到“薄膜”現象時(shí)，倒掉消化液，再繼續作用2~3分鐘，輕輕搖動(dòng)，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來(lái)，在顯微鏡下可發(fā)現細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時(shí)應立即終止消化。（4）加入完全培養基5mL，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過(guò)大，盡可能不要出現泡沫，以避免細胞的機械損傷。（5）用計數板計數，計算細胞的濃度，并用培養基調整適當的細胞濃度后再分瓶培養。
傳代細胞的建系和維持
1、細胞檔案：細胞檔案要記錄好，如組織來(lái)源、生物學(xué)特性（由形態(tài)、生長(cháng)繁殖曲線(xiàn)、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無(wú)支原體和潛存病毒等）、培養基的要求、傳代換液時(shí)間、擴增時(shí)間（分裂指數），細胞的特殊遺傳標志（標記染色體）等，這些記錄對于細胞的正常生長(cháng)，保持細胞的一致和經(jīng)長(cháng)期培養細胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。
2、換液傳代：（1）細胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規律性，因而在繼續傳代時(shí)，要注意保持其穩定的規律性，這樣可以減少由于傳代時(shí)細胞密度的頻繁增減或換液時(shí)間的不規律而導致細胞生長(cháng)特性的改變，給以后的實(shí)驗帶來(lái)影響。（2）多種細胞系維持傳代，要嚴格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉。每傳5代后，細胞種子均應凍存。傳代時(shí)均應作好記錄，培養瓶上要有明顯標記，標記細胞系名稱(chēng)和傳代的代數及傳代時(shí)間。細胞種子的及時(shí)凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細胞變異，此外還可提供不同代次的細胞同時(shí)進(jìn)行對比試驗。" "

購買(mǎi)的細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？研究人員在細胞培養時(shí)出現存活率不佳，原因比較復雜，常見(jiàn)原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質(zhì)不佳；血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過(guò)程錯誤；冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心；懸渾細胞誤認為死細胞；培養溫度使用錯誤；細胞置于-80℃太久等。建議嚴格參照ATCC的標準操作規程進(jìn)行細胞復蘇、凍存等工作。
欲將一般動(dòng)物細胞離心下來(lái)，其離心速率應為多少轉速?欲回收動(dòng)物細胞，其離心速率一般為300×g(約1OOOrpm),5-10分鐘，轉速過(guò)高或離心時(shí)間過(guò)長(cháng)都將造成細胞死亡。合適的離心轉速是根據相對離心力決定。RCF=1.119×105×r×(rpm)2，其中r為離心機轉軸中心與離心套管底部?jì)缺诘木嚯x；rpm為離心機每分鐘的轉數；RCF(relative centrifugal force)為相對離心力，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數來(lái)表示單位。
為什么培養的細胞要及時(shí)傳代？體外培養的細胞大多具有生長(cháng)接觸抑制的特性，也就是說(shuō)當一個(gè)細胞被其他細胞包圍的時(shí)候，它就會(huì )停止生長(cháng)，及時(shí)傳代后，細胞的生長(cháng)得以繼續。
培養細胞生長(cháng)減慢的原因在哪些?其解決辦法有哪些？可能的原因有：更換了不同的培養液或血清；培養液中一些細胞生長(cháng)必需成分如谷氨眈肢或生長(cháng)因子等耗盡或缺乏或己被破壞；培養物中有少量細菌或真菌污染；試劑保存不當；比較新培養液與原培養液成分，比較新血清與舊血清等，找出其它可能的原因。
解決辦法：增加起始培養細胞濃度；讓細胞逐漸適應新培養液；換入新鮮配制培養液；補加谷氨酷肢或生長(cháng)因子等；用無(wú)抗生素培養液培養，如發(fā)現污染，去棄培養物，或用抗生素除菌；血清需保存在5℃到20℃; 培養液需在2-8℃避光保存;含血清完全培養液在2-8℃保存，并在2周內用完;分離培養物，檢測支原體。
冷凍管應如何解凍？取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1-2分鐘內大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺操作細胞，用75%酒精消毒凍存管，用新鮮培養基將細胞轉移至培養瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，注意安全，預防冷凍管爆裂。" "

傳代培養及其操作步驟：原代細胞培養成功以后，需要進(jìn)行分離培養，否則細胞會(huì )因生存空間不足或密度過(guò)大，營(yíng)養障礙，影響細胞生長(cháng)。細胞由原培養瓶?jì)确蛛x稀釋后傳到新的培養瓶中培養的過(guò)程稱(chēng)之為傳代培養。傳代細胞允許培養的細胞擴增(形成細胞株)，可以進(jìn)行細胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征。傳代細胞形成細胞株的大利處在于提供了大量持久的實(shí)驗材料，便于實(shí)驗。
傳代細胞培養操作步驟：（1）吸掉或倒掉培養瓶?jì)扰f培養液。（2）向瓶?jì)燃尤胍鹊鞍酌敢汉虴DTA混合液少量。以能覆蓋培養瓶底為宜。（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進(jìn)行消化，2-5min后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，當發(fā)現胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。（4）吸出消化液，向瓶?jì)燃尤際anks液少量，輕輕轉動(dòng)培養瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養液，終止消化。（5）使用彎頭吸管，吸取瓶?jì)扰囵B液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，以防用力過(guò)猛損傷細胞。（6）用計數板計數后，分別接種于新的培養瓶中，置CO2培養箱中進(jìn)行培養。（7）細胞培養換液時(shí)間應根據細胞生長(cháng)的狀態(tài)和實(shí)驗要求來(lái)確定。一般2-3d后應換一次生長(cháng)液。待細胞鋪滿(mǎn)器皿底面，即可使用；也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。
傳代細胞培養注意事項：（1）掌握好細胞消化的時(shí)間，消化時(shí)間過(guò)短時(shí)，細胞不宜從瓶壁脫落，過(guò)長(cháng)的消化會(huì )導致細胞脫落、損傷。（2）掌握好消化濃度，當消化液濃度過(guò)高時(shí)，消化時(shí)間應縮短，過(guò)低時(shí)細胞消化時(shí)間相對延長(cháng)。
體內細胞培養及其操作步驟：瘤細胞懸液接種（1）無(wú)菌選取生長(cháng)良好(有光澤，淡紅色)瘤組織或對數生長(cháng)期培養瘤細胞。（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經(jīng)80～100目篩網(wǎng)過(guò)濾成細胞懸液。（3）培養細胞應用PBS洗兩遍。（4）計數并調整細胞濃度至10(7)～10(8)/ml。（5）常規消毒后，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫用注射器皮下潛行一段后注入細胞懸液(0.1ml/部位，＞10(6)細胞)。初次接種成功率低，細胞數盡可能多一些。（6）次日注意觀(guān)察動(dòng)物一般情況。初次接種一般有一段較長(cháng)的潛伏期，以后隨著(zhù)傳代潛伏期逐漸縮短，后固定為一個(gè)相對穩定的時(shí)間。
腹水瘤的建立與腹水瘤的接種：將實(shí)體瘤細胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤細胞，將這種腹水反復傳代，即可成為腹水瘤。初次傳代時(shí)，腹水常呈血性(含大量紅細胞)，反復傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過(guò)程如下。（1）將凍存或培養的腹水瘤細胞離心和洗滌，進(jìn)行細胞計數。（2）消毒動(dòng)物，左下腹穿刺接種1×10(6)腹水瘤細胞。（3）接種腹水瘤細胞后約7-12d，待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3-5ml。（4）抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min，收集上清，分裝凍存備用。
培養細胞的凍存及復蘇：細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術(shù)。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時(shí)間幾乎是無(wú)限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。
凍存細胞：（1）選對數增生期細胞(證明無(wú)支原體污染)，在凍存前1d換液。（2）按常規方法把培養細胞制備成懸液，計數，使細胞密度達5×10(7)/ml左右密度，離心，去上清。（3）加入配制好的凍存液（培養液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時(shí)培養液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點(diǎn)降低，使細胞內水分在凍結前透出細胞外。（4）分裝于無(wú)菌凍存管中，每管加1.5m懸液。（5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標記。（6）凍存：在特殊的儀器或簡(jiǎn)易的液氮容器中，按-1℃/min的速度，在30～40min時(shí)間內，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過(guò)快能影響細胞內水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。操作時(shí)應戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。
復蘇細胞：（1）從罐中取出凍存管。（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時(shí)搖動(dòng)，使其融化，30～60s內完成。（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開(kāi)蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養液。（4）低速離心(500～1000r/min) 5min，去上清后再用培養液洗一次。（5）用培養液適當稀釋后，裝入培養瓶37℃培養，次日更換一次培養液后，繼續培養。以后仍按常規進(jìn)行培養。凍存細胞數量要充分，密度應達到10(7)/ml，在融后稀釋20倍時(shí)，仍能保持5×10(5)/ml數量。" "

公司已合作單位有山西中醫學(xué)院、福建醫科大學(xué)附屬第二醫院、上海市第六人民醫院、北京大學(xué)醫學(xué)部、四平中心醫院、廣州中醫藥大學(xué)、中科院上海生命科學(xué)研究院生化與細胞研究所、解放軍第306醫院、江南大學(xué)、西南醫院、吉首大學(xué)、西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院、寧波大學(xué)、福建醫科大學(xué)附屬醫院、中南大學(xué)、延安大學(xué)附屬醫院、中國科學(xué)院上海藥物研究所、天津市兒童醫院、江蘇省中醫藥研究院、湘雅醫學(xué)院、第四軍醫大學(xué)預防系勞動(dòng)與環(huán)境教研室、揚州大學(xué)、上海交通大學(xué)、中國醫科大學(xué)、浙江省立同德醫院、中國人民解放軍第150中心醫院、蘇州大學(xué)、四川大學(xué)華西醫院、云南大學(xué)、揚州大學(xué)獸醫學(xué)院、上海交通大學(xué)醫學(xué)院附屬第九人民醫院、海南醫學(xué)院、江蘇腫瘤醫院、上海市閔行區中心醫院、大連醫科大學(xué)附屬醫院、中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院、沈陽(yáng)藥科大學(xué)、廣州市第八人民醫院、南京大學(xué)、浙江中醫藥大學(xué)、蘭州大學(xué)、上海中醫藥大學(xué)、中國農業(yè)科學(xué)院飼料研究所、廈門(mén)市婦幼保健院、重慶大學(xué)、南京軍區總醫院、天津市人民醫院、北京醫學(xué)科學(xué)腫瘤醫院、江蘇大學(xué)、桂林醫學(xué)院附屬醫院、中國科學(xué)院化學(xué)研究所、、鄭州大學(xué)附屬醫院、湖北省人民醫院、四川大學(xué)華西第二醫院、廣州中醫藥大學(xué)附屬醫院、黑龍江中醫藥大學(xué)附屬醫院、青海紅十字醫院、廣州醫學(xué)院附屬醫院、北京紅十字朝陽(yáng)醫院、中國醫科大學(xué)附屬一院、江西中醫學(xué)院附屬醫院、北京中醫藥大學(xué)東直門(mén)醫院、山西醫科大學(xué)附屬醫院、上海長(cháng)海醫院、北京阜外醫院、北京安貞醫院、上海遠大心胸醫院、哈爾濱醫科大學(xué)臨床醫學(xué)院、廣東霍英東心臟中心、中山醫科大學(xué)中山眼科中心、天津眼科醫院、溫州醫學(xué)院附屬眼視光醫院、北京兒童醫院、重慶醫科大學(xué)附屬兒童醫院、復旦大學(xué)附屬兒童醫院、南京中醫藥大學(xué)附屬第二醫院、湖北十堰市太和醫院、濟南市兒童醫院、中南大學(xué)湘雅二醫院、天津醫科大學(xué)代謝病醫院" "

C4212 NCI-H596人肺腺鱗癌復蘇培養細胞株
C4213 NCI-H23人非小四代細胞肺癌復蘇培養細胞株
C4214 NCI-H2087人非小四代細胞肺腺癌復蘇培養細胞株
C4215 A549人肺腺癌復蘇培養細胞株
C4216 A-427人肺癌復蘇培養細胞株
C4217 SK-MES-1人肺鱗癌復蘇培養細胞株
C4218 Calu-3人肺腺癌四代細胞(胸膜滲出液)
C4219 Calu-6人肺癌四代細胞系(未分化)
C4220 MRC-5人胚肺復蘇培養細胞株
C4221 WI-38人胚肺復蘇培養細胞株
C4223 PLC/PRF/5人肺癌亞歷山大四代細胞系
C4224 SK-LU-1人低分化肺腺癌復蘇培養細胞株
C4229 Hs888Lu人肺成纖維復蘇培養細胞株
C4235 NCI-H209人小四代細胞肺癌
C4300 786-O人腎透明四代細胞腺癌復蘇培養細胞株
C4301 293TSV40永生化的人胚腎上皮復蘇培養細胞株
C4302 293T/17SV40T轉化的人胚腎四代細胞(亞系)
C4304 HK-2人腎小管近段上皮復蘇培養細胞株
C4305 769-P人腎癌四代細胞系(769-P)
C4306 Caki-1人腎透明四代細胞癌皮膚轉移復蘇培養細胞株
C4307 SW-13人腎上腺皮質(zhì)腺癌復蘇培養細胞株
C4308 A498人腎癌四代細胞系
C4309 ACHN人腎癌四代細胞系
C4311 T24人膀胱移行四代細胞癌復蘇培養細胞株
C4312 ScaBER人膀胱鱗癌復蘇培養細胞株
C4313 RT4膀胱癌復蘇培養細胞株
C4314 J82膀胱癌復蘇培養細胞株
C4315 5637人膀胱癌復蘇培養細胞株
C4316 Y1腎上腺皮質(zhì)復蘇培養細胞株
C4317 A-704人腎癌復蘇培養細胞株
C4400 MCF-7人復蘇培養細胞株
C4403 MDA-MB-231人復蘇培養細胞株
C4404 MDA-MB-468人復蘇培養細胞株
C4406 HCC1937人復蘇培養細胞株
C4407 MDA-MB-415人復蘇培養細胞株
C4408 MDA-MB-435S人復蘇培養細胞株
C4409 MDA-MB-436人復蘇培養細胞株
C4410 MDA-MB-453人乳腺導管癌復蘇培養細胞株
C4411 SK-BR-3人復蘇培養細胞株
C4412 4T1人復蘇培養細胞株
C4413 HCC38人乳腺導管癌復蘇培養細胞株
C4414 BT-549人復蘇培養細胞株
C4415 BT-474人乳腺導管瘤復蘇培養細胞株
C4416 CCD-1095Sk人乳腺浸潤性導管癌旁皮膚復蘇培養細胞株
C4418 Sw626人卵巢癌復蘇培養細胞株
C4419 OVCaR-3人卵巢癌復蘇培養細胞株
C4420 Caov-3人卵巢癌復蘇培養細胞株
C4421 PA-1人卵巢畸胎瘤復蘇培養細胞株
C4422 SK-OV-3人卵巢癌復蘇培養細胞株
C4423 ES-2人卵巢透明四代細胞癌復蘇培養細胞株
C4424 HEC-1-A人子宮內膜腺癌復蘇培養細胞株
C4425 HEC-1-B人子宮內膜腺癌復蘇培養細胞株
C4427 KLE人子宮內膜腺癌復蘇培養細胞株
C4428 HeLa人宮頸癌復蘇培養細胞株"